Inżynieria genetyczna otwiera przed ludzkością możliwości tworzenia wcześniej nieistniejących organizmów i niszczenia chorób genetycznych. Jednak sytuacja nie wygląda tak różowo, ponieważ nawet przełomowa technologia CRISPR / Cas9 jest daleka od doskonałości. Błędy, które popełnia, mogą być rzadkie, ale jeden wystarczy, aby stać się śmiertelnym dla człowieka. Lenta.ru opowiada o tym, co jest nie tak z CRISPR i jak naukowcy próbują naprawić sytuację.
System CRISPR / Cas9 - rodzaj nożyczek DNA - słusznie uważany jest za rewolucję w dziedzinie inżynierii genetycznej. Z jego pomocą naukowcy mogą edytować ludzki genom, usuwając z niego szkodliwe mutacje, a tym samym leczyć nieprzyjemne i śmiertelne choroby dziedziczne. Nie należy jednak myśleć, że wcześniej takich metod nie było. W arsenale genetyków znalazły się np. Nukleazy zawierające „palce” cynkowe oraz endonukleazy - enzymy rozbijające cząsteczki DNA w określonych miejscach. Pod względem dokładności, wszechstronności i kosztów są zauważalnie gorsze od CRISPR / Cas9, chociaż ten ostatni jest daleki od doskonałości.
CRISPR / Cas9 został pierwotnie stworzony nie przez naukowców, ale przez naturę. Jest to mechanizm molekularny wewnątrz bakterii, który pozwala im zwalczać bakteriofagi i inne pasożyty. W rzeczywistości działa jako odporność na infekcje. CRISPR (oznacza „krótkie powtórzenia palindromiczne, regularnie rozmieszczone w grupach”) to specjalne regiony (loci) DNA. Zawierają krótkie fragmenty wirusów DNA, które niegdyś zakażały przodków dzisiejszych bakterii, ale zostały pokonane przez ich wewnętrzną obronę. Te elementy nazywane są odstępnikami i są oddzielone od siebie powtarzającymi się sekwencjami.
Kiedy bakteriofag atakuje bakterię, każda powtarzająca się sekwencja i sąsiednia sekwencja rozdzielająca są używane jako matryca do syntezy cząsteczek zwanych crRNA. Powstaje wiele różnych łańcuchów RNA, które wiążą się z białkiem Cas9, którego zadanie jest niezwykle proste: przeciąć DNA wirusa. Jednak będzie mógł to zrobić dopiero po tym, jak crRNA znajdzie komplementarny fragment wirusowego DNA. Po tym, jak Cas9 rozpada obcy kwas nukleinowy, ten ostatni jest całkowicie niszczony przez inne nukleazy.
CRISPR / Cas9 jest dobry właśnie ze względu na swoją dokładność, ponieważ dla bakterii prawidłowe funkcjonowanie układu odpornościowego to sprawa życia i śmierci. System „antywirusowy” musi znaleźć sekcję wirusowego DNA pośród miliona innych i, co najważniejsze, nie mylić go z własnym genomem. W ciągu milionów lat ewolucji bakterie udoskonaliły ten mechanizm. Więc zaraz po tym, jak zorientowali się, dlaczego potrzebny jest system CRISPR, zdali sobie sprawę, że można go oswoić jako bezprecedensowo dokładne narzędzie do edycji genów.
Aby zastąpić jeden określony region w genomie innym, konieczne jest zsyntetyzowanie przewodniego RNA, który jest zasadniczo podobny do crRNA. Mówi Cas9, gdzie konieczne jest dokonanie podwójnej przerwy w DNA zmodyfikowanego organizmu. Nie musimy jednak psuć genu, tylko go modyfikować - na przykład podmienić jeden lub więcej nukleotydów i usunąć szkodliwą mutację. Tutaj natura znów przychodzi na ratunek. Naturalne mechanizmy naprawcze natychmiast zaczynają odnawiać przecięty łańcuch. Sztuczka polega na tym, że aby to zrobić, niektóre fragmenty RNA są usuwane w pobliżu pęknięcia, po czym wstawiane są tam podobne sekwencje. Naukowcy mogą zastąpić je własnymi sekwencjami DNA i zmodyfikować w ten sposób genom.
Schematyczne przedstawienie CRISPR
Film promocyjny:
Zdjęcie: Kaidor / Wikipedia
Jednak nic nie jest idealne. Pomimo względnej dokładności systemy CRISPR czasami popełniają błędy. Jeden z powodów tkwi w samej naturze systemu. Dla bakterii jest to niekorzystne, aby crRNA pokrywał się w 100 procentach z fragmentem wirusowego DNA, który może różnić się o jeden lub dwa nukleotydy. Lepiej dla niej, żeby niektóre nukleotydy były inne, co daje mikroorganizmowi większą szansę na zwalczenie infekcji. Jednocześnie w inżynierii genetycznej niska specyficzność grozi błędami: zmiany można wprowadzić w niewłaściwym miejscu. Jeśli zdarzy się to w trakcie eksperymentów na myszach, to nie ma szczególnej tragedii, ale edycja ludzkiego genomu może przerodzić się w katastrofę.
To wyjaśnia obawy zachodnich naukowców związane z eksperymentami przeprowadzanymi w Chinach. Azjatyccy naukowcy wykorzystali technologię CRISPR do genetycznej modyfikacji ludzkich embrionów. Takie eksperymenty zostały zakazane w Europie i Stanach Zjednoczonych, ale ostatnio Wielka Brytania zezwoliła na nie - wyłącznie w celach badawczych. Takie embriony będą musiały zostać zniszczone w ciągu kilku tygodni po otrzymaniu, co wyklucza „rozmnażanie” ludzi GM.
Jednak CRISPR / Cas9 nie byłby taki wspaniały, gdyby nie można go było ulepszyć. Tak więc naukowcy nauczyli Cas9, aby przecinał nie dwa łańcuchy naraz, ale tylko jeden. Cięcie jest wykonywane w dwóch różnych miejscach w sekwencji DNA na różnych niciach, więc system musi być w stanie rozpoznać dwa razy więcej nukleotydów niż normalnie, dzięki czemu jest dokładniejszy.
Białko Cas i crRNA
Zdjęcie: Thomas Splettstoesser / Wikipedia
Naukowcy z University of Western Ontario znaleźli inny sposób na ulepszenie tej technologii. Próbowali rozwiązać problem naprawy przeciętego DNA. Szybka odbudowa łańcucha kwasu nukleinowego prowadzi do tego, że naukowcy nie mają czasu na dokonywanie własnych poprawek w genomie. W ten sposób powstaje błędne koło: łańcuch naprawiony w niepożądany sposób trzeba ponownie przeciąć białkiem Cas9.
Aby temu zapobiec, naukowcy zmodyfikowali nożyczki do białek, aby stworzyć białko TevCas9. Przecina nić DNA w dwóch miejscach, utrudniając naprawę tego miejsca. Aby zsyntetyzować nowy enzym, do Cas 9 dodano enzym I-Tevl, który jest również endonukleazą, czyli białkiem, które rozszczepia cząsteczkę DNA w środku, a nie odcina końce sekwencji, jak robią to egzonukleazy. Powstałe białko fuzyjne okazało się dokładniejsze w wiązaniu się z określonymi miejscami i rzadziej popełniło błąd i przecięło niewłaściwe miejsce.
Struktura krystaliczna Cas9 związana z DNA
Zdjęcie: projekt wiki Cas9 / Wikipedia
Istnieje inny sposób na poprawę dokładności systemów CRISPR. „Wyścig zbrojeń” między bakteriami i wirusami doprowadził nie tylko do rozwoju systemów obronnych mikroorganizmów, ale także do sposobów ich neutralizacji. W ten sposób bakteriofagi mutują szybko, tracąc obszary, na których rozpoznaje je odporność bakterii. Jednak jakiś kod dla białek anty-CRISPR, zakłócający pracę kompleksu crRNA-Cas9.
8 grudnia w czasopiśmie Cell opublikowano artykuł naukowców z University of Toronto, którzy stworzyli „anty-CRISPR” - system, który pozwala wyłączyć mechanizm pod pewnymi warunkami. Zapobiega niepożądanym błędom poprzez tłumienie aktywności Cas9 w przypadku, gdy przewodnik RNA wiąże się z niewłaściwym fragmentem. Anti-CRISPR składa się z trzech białek, które hamują nukleazę i są kodowane przez geny jednego z wirusów bakteryjnych.
Już teraz technologia CRISPR jest stosowana w leczeniu poważnych chorób, takich jak białaczka i rak płuc, a także jest testowana w celu usunięcia wirusa HIV z komórek odpornościowych. W miarę poszukiwania przez naukowców nowych sposobów ulepszania tej metody, będzie się otwierać coraz więcej możliwości jej zastosowania.
Alexander Enikeev