Próbki tkanek mumii pod nazwami „Maria” i „Vavita” zostały wysłane z Peru do rosyjskiego laboratorium do badań. Dostarczone próbki tkanek biologicznych przebadano za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, widma Ramana, ICPE oraz zbadano skład ziemi okrzemkowej (substancji na powierzchni skóry mumii). Przeprowadzono również badanie DNA przenoszonych tkanek.
przygotowanie próbki
Próbki tkanek, każda po 500 μg, przeniesiono do plastikowych probówek i rozpuszczono w 1 ml buforu (10 mM Tris-HCl pH = 10,5, 1 mM EDTA, 0,15 M NaCl). Do otrzymanych zawiesin dodano dodecylosiarczan sodu do 0,5%, ogrzano do +80 ° C i po 10 minutach proteinazy K (do 500 μg / ml) umieszczono w termostacie (+55 ° C) na 24 godziny.
Odbiałczanie prowadzono metodą fenolową: do zawiesiny dodawano równą objętość fenolu, następnie fenol: chloroform (1: 1), chloroform; po każdym dodaniu prowadzono ciągłe mieszanie na rotorze kątowym i wirowanie przy 15 tys. obr./min przez 10 min.
Do otrzymanego po trzecim wirowaniu superosadu dodano 1/10 części objętości 1 M NaCl i 2,5 objętości dwukrotnie destylowanego alkoholu etylowego i pozostawiono na noc w -30 ° C w stożkowych probówkach - „Eppendorf”. Wirowanie przeprowadzono przy 15 tys. Obj. min. w ciągu 10 minut i otrzymany DNA „wytrącił się” w postaci brązowego osadu. Osad DNA przemyto dwukrotnie 70% alkoholem etylowym i wysuszono w temperaturze pokojowej (1 h), a następnie rozpuszczono w buforze TE.
PCR przeprowadzono na programowalnym termocyklerze „My Cycler” („Bio = Rad”) stosując standardowe oligoprimery syntetyzowane metodą na fazie stałej w stowarzyszeniu „Beagler” (St. Petersburg). Mieszanina reakcyjna do amplifikacji o objętości 25 μl zawierała: 15 nM każdego oligoprimeru, 67 mM Tris-HCI pH = 8,8 w + 25 C, 16,6 mM (NH4) SO4, 6,7 mM MgCl2, 6,7 μM EDTA, 10 mM 2 merkaptoetanol, 170 μg / ml BSA i mieszanina czterech podstawowych dNTP o stężeniu 1,0 mM każdy i termostabilnej polimerazy DNA Thermus thermophilis (5 U / μl) (NPO SibEnzim). Po denaturacji (10 min, 94 ° C) przeprowadzono 35 cykli amplifikacji dla każdego układu testowego: 94 ° C - 1 min, 58 ° C - 1 min, 72 ° C - 1 min. W celu kontroli swoistości do reakcji wprowadzono próbki DNA o znanych genotypach dla badanych loci (układów markerowych), a także próbki kontrolne.zawierające mieszaninę odczynników bez DNA. Po amplifikacji do podwielokrotnych próbek mieszaniny reakcyjnej (7 μl) dodano bufor barwiący i rozdzielono metodą elektroforezy pionowej w 6% żelu poliakryloamidowym (210 x 150 x 1 mm), barwiono bromkiem etydyny i fotografowano w świetle ultrafioletowym. Aby zidentyfikować allele, zastosowano standardy alleliczne odpowiadające tym loci („drabiny”).
Film promocyjny:
Analiza DNA
Do badań wykorzystaliśmy metodę analizy egzomu ludzkiego DNA opartą na sekwencjonowaniu wysokoprzepustowym ze wzbogaceniem przez hybrydyzację.
Technika analizy egzomu ludzkiego DNA.
Przeanalizowano 2 próbki … Wszystkie etapy przygotowania próbki przed PCR zostały przeprowadzone w czystych pomieszczeniach. Przygotowanie próbek, ekstrakcję DNA i amplifikację poszczególnych fragmentów DNA przeprowadzono w różnych pomieszczeniach.
Specyficzne adaptery (zestaw KAPA Library Preparation Kit i SeqCap Adapter Kit; Roche) zligowano z końcami pofragmentowanego genomowego DNA (~ 5 ng), po czym przeprowadzono dwuetapową selekcję fragmentów w zakresie długości 200-350 pz przy użyciu koralików AMPureXP Beads (Beckman Coulter) … Powstałe fragmenty amplifikowano ze starterami specyficznymi dla adaptera i hybrydyzowano z biotynylowanymi sondami specyficznymi (NimbleGen SeqCap EZ Choice MedExome; Roche) przez 28 godzin w 47 ° C. W jednej reakcji połączono dwie próbki DNA. Biotynylowane hybrydy sonda-DNA zostały wyizolowane i oczyszczone za pomocą skoniugowanych ze streptowidyną cząstek magnetycznych; przeprowadzono drugą amplifikację i ocenę jakościową powstałej biblioteki DNA (TapeStation 4200; Agilent Technologies). W celu usunięcia poza celem fragmentów amplifikacji i dimerów adapterów, bibliotekę DNA ponownie oczyszczono przy użyciu magnetycznych cząstek AMPureXP Beads (ryc. 1). Końcowe stężenie przygotowanej biblioteki oceniano na urządzeniu Quantus przy użyciu dostępnego w handlu zestawu QuantiFluor® dsDNA System (Promega). Otrzymaną bibliotekę DNA unieruchomiono na powierzchni komórki przepływowej. Sekwencjonowanie przeprowadzono na platformie Illumina przy użyciu Standard Flow Cell i MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 x 150 cykli). Otrzymaną bibliotekę DNA unieruchomiono na powierzchni komórki przepływowej. Sekwencjonowanie przeprowadzono na platformie Illumina przy użyciu Standard Flow Cell i MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 x 150 cykli). Otrzymaną bibliotekę DNA unieruchomiono na powierzchni komórki przepływowej. Sekwencjonowanie przeprowadzono na platformie Illumina przy użyciu Standard Flow Cell i MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 x 150 cykli).
Postać: 1
Ogólna ocena jakości sekwencjonowanego DNA
Do wstępnej oceny jakości wykorzystano standardowe metody, takie jak FastQC oraz programy Jellyfish i KraTER. Ocena jakości nie wykazała problemów z jakością odczytów sekwencjonowanego DNA dla obu próbek. Zdjęcia nie są pokazane, ponieważ nie mają charakteru informacyjnego.
Dla pierwszej próbki (dalej M, duża mumia „Maria”) zsekwencjonowano 113,4 M odczytów, dla drugiej próbki (dalej W, mała mumia „WaWita”) 22,9 M odczytów.
Następnym krokiem było oczyszczenie odczytów sekwencyjnych z różnych sekwencji technicznych, które zakłócałyby dalszą analizę. W tym celu wykorzystano program Cookiecutter. Po czyszczeniu odnotowano odpowiednio 113,3 mln (99%) odczytów i 22,8 mln (99%) odczytów odpowiednio dla M i W.
Oszacowanie ilości starożytnego DNA i jego oddzielenie od współczesnego
Standardową metodą oceny obecności i ilości starożytnego DNA jest oszacowanie ilości nukleotydów uszkodzonych w czasie. W tym celu wykorzystano program MapDamage 2.0. MapDamage 2.0, który wykazał ilość starożytnego DNA w 30,1%, ale ponieważ MapDamage sugeruje, że używamy bliskiego odniesienia i nie wiemy dokładnie, jak blisko są obie próbki do genomu współczesnego człowieka, i użyliśmy biblioteki egzomów, sama metoda nie była wystarczający. Inną dobrą metodą oceny starożytnego DNA jest liczba krótkich fragmentów.
Filtracja rzekomego starożytnego DNA odbywała się w trzech etapach. Na pierwszym etapie usunęliśmy wszystkie sparowane odczyty, których nie można skrzyżować i połączyć w jeden niesparowany odczyt z nakładaniem się. Te odczyty wskazywały, że oryginalny fragment, który zsekwencjonowano, był dłuższy niż 300 pz. i najprawdopodobniej współczesne DNA. Zatem po tym kroku pozostało odpowiednio 86,9% i 91,8%. Następnie wybrano pojedyncze zachodzące na siebie fragmenty tak, aby ich długość była krótsza niż 150 pz, ponieważ jest to długość, jakiej oczekiwaliśmy dla starożytnego DNA. Po tym kroku pozostało odpowiednio 8,6% i 38,5% dla próbek M i W. Należy zauważyć, że pomimo różnicy w procentach bezwzględna liczba odczytów między próbkami M i W jest bardzo zbliżona: 9,8M i 8,8M, co można tłumaczyć tym, że zawartość starożytnego DNA w obu próbkach jest podobna.
| Parametr | Próbka M (Maria) | Próbka W (Wawita) |
| Liczba odczytów | 113,3 mln | 22,8 mln |
| Odsetek krótkich fragmentów <300 pz | 86,9% | 91, 8% |
|
Odsetek krótkich fragmentów <150 pb (liczba) |
8,6% (9846 035) |
38, 5% (8 813 220) |
|
Odsetek fragmentów dopasowanych do ludzkiego genomu (liczba) |
2,03% (2345 084) |
9,65% (2 264 551) |
| Procent fragmentów dopasowanych do ludzkiego genomu od krótkich <150 pz | 23,8% | 25,6% |
Uzyskanie DNA podobnego do referencyjnego genomu ludzkiego
Powstały domniemany pradawny DNA został zmapowany do referencyjnego genomu ludzkiego przy użyciu standardowego potoku wyszukiwania wariantów genomowych przy użyciu BWA, samtools i Wcftools.
Co więcej, tylko 23,8% próbki M i 25,6% zostało pomyślnie zmapowanych do referencyjnego genomu współczesnych ludzi. Jednocześnie dla obu próbek 75% zsekwencjonowanych odczytów nie mogło zostać zmapowanych na ludzki genom. Można to wytłumaczyć zarówno zanieczyszczeniem, jak i faktem, że próbki te znajdują się wystarczająco daleko od genomu współczesnego człowieka. Jednocześnie warto mieć na uwadze, że zsekwencjonowaliśmy bibliotekę egzomów i tym samym zminimalizowaliśmy zanieczyszczenie bakteryjnego DNA.
Wstępna analiza rekonesansowa niegotowanych odczytów wykazała, że niektóre z nich należały do powtarzalnego DNA specyficznego dla kopytnych, co można wytłumaczyć faktem, że do mumifikacji użyto tłuszczu lamy.
Aby uzyskać bardziej szczegółową analizę, obliczenia trwają około trzech tygodni, ponieważ istniejące rozwiązania zostały wykonane tylko dla genomów wirusów i bakterii i musimy porównać wszystkie istniejące genomy, w tym genomy roślin, aby zrozumieć, które gatunki zostały zsekwencjonowane.
Charakterystyka znalezionych opcji
Zmapowane odczyty wykorzystano do poszukiwania wariantów odróżniających próbki M i W od współczesnego ludzkiego genomu, a także do oceny zanieczyszczenia odczytów z ludzkiego chromosomu Y.
Pierwszym pytaniem, na które należało odpowiedzieć, było to, do których chromosomów zmapowano odczyty zsekwencjonowane.
Ponieważ wiemy, że próbki Marii zostały wyizolowane z kości i mięśni, a próbki Vavity tylko z kości, spodziewaliśmy się różnicy w ilości mtDNA. Ale nie było dużej różnicy.
Liczba odczytów mapowanych na Y to kolejny test na zanieczyszczenie przez współczesnych ludzi. Co ciekawe, okazał się taki sam w obu próbkach.
Statystyki znalezionych wariantów przedstawiono poniżej:
| Parametry | Próbka M (Maria) | Próbka W (Wawita) |
| Liczba znalezionych opcji | 79957 | 48941 |
| Liczba opcji na Y | 534 | 541 |
| Liczba niezawodnych opcji (ponad 20 odczytów i ponad 30 jakości) | 16969 | 6181 |
| Warianty ze znanym rsid (dostępne w bazie danych wycinków) | 5701 | 3089 |
| Ogólne prawidłowe opcje | 92 | |
| wspólne opcje z rsid | 49 |
Potem można było odpowiedzieć na pytanie: czy M i W są krewnymi? Odpowiedź brzmi nie.
Znaleziono tylko 49 pasujących wariantów między M i W a 3040 różniących się dla wariantów o znanym rsid. Co więcej, być może są to różne typy lub podgatunki osoby lub nieznanego stworzenia.
Co ciekawe, warianty z chromosomem Y są identyczne dla obu próbek, co wskazuje na zakażenie przez tę samą osobę, a w starożytnym DNA chromosomu Y prawdopodobnie nie ma chromosomu.
Ocena podobieństwa z istniejącymi sekwencjonowanymi genomami ludzkimi z projektu 1000 Human Genome Project
Zauważ, że jest to tylko przybliżona analiza, ponieważ do dokładniejszej analizy potrzebne są warianty z regionów genomu podlegających selekcji neutralnej i mamy dane z egzomu.
Niemniej jednak, używając 5708 wariantów dla M lub 3096 dla S, możliwe było przeprowadzenie wariantu analizy w porównaniu z danymi 1000 ludzkich genomów.
Wynikiem analizy PCA na poniższym obrazku jest nałożenie dwóch obrazów dla M i W, obliczonych osobno, ponieważ jest zbyt mało wspólnych opcji między M i W, aby oszacować odległości między M i W.
Wynik podobieństwa.
Jak widać, nie ma zbiegów okoliczności z jakąkolwiek grupą genów, one też się od siebie różnią. Należy jednak pamiętać, że użyliśmy sekwencji kodujących w ramach selekcji i zaleca się stosowanie wariantów w ramach selekcji neutralnej.
Niemniej jednak wynik PCA dobrze zgadza się z ręczną weryfikacją wariantów, która wykazała, że dane są w postaci homozygot bez odniesień, co ponownie wskazuje, że obrazy są dalekie od współczesnego ludzkiego genomu.
Wniosek
Niestety byliśmy ograniczeni tylko do dwóch próbek, zwykle w tego typu analizach używa się więcej, przynajmniej 3-10 przynajmniej w jakiś sposób powiązanych. Dlatego konieczne jest kontynuowanie badań z dużą liczbą próbek.
Jednocześnie najprawdopodobniej możemy stwierdzić, że próbki DNA Mary i Vavity odpowiadają ludzkiemu DNA, ale nie pokrywają się z DNA dostępnym dla nas z bazy danych 1000 osób.
Autorzy raportu: Baranov V. S. i Aseev M. V. (Instytut Badań Naukowych Położnictwa i Ginekologii, Zakład Diagnostyki Prenatalnej), Glotov A. S. i Glotov O. S. (St. Petersburg State University), A. S. Komissarov (Instytut Cytologii, Rosyjska Akademia Nauk, Centrum Bioinformatyki Genetycznej).
Materiały dostarczone przez Konstantina Georgievicha Korotkowa (doktora nauk technicznych, profesora, Uniwersytet Technologii Informacyjnych, Mechaniki i Optyki) i Dmitrija Władysławowicza Galetsky'ego (kandydata nauk medycznych, I. P. Pavlov First St. Petersburg State Medical University).
Aby uzyskać więcej informacji na temat mumii z Nazca, zobacz tag: mumie z Nazca.