Naukowcy wiążą duże nadzieje z technologią CRISPR / Cas9, która umożliwia bardzo precyzyjne zmiany w genomach żywych organizmów, w tym ludzi. Publikowane są wszystkie nowe artykuły naukowe opisujące różne typy systemów CRISPR, a także ich modyfikacje. „Lenta.ru” opowiada o odkryciach w tej dziedzinie dokonanych w 2016 roku.
Tysiące z nich
CRISPR / Cas9 to adaptacyjny system odporności bakteryjnej, który pozwala mikroorganizmom zwalczać wirusy. Składa się z odstępników - odcinków DNA odpowiadających pewnym fragmentom (protoprzerywaczom) DNA czynnika zakaźnego. Odstępniki kodują określone cząsteczki crRNA, które wiążą się z enzymem Cas9. Powstały kompleks przyczepia się do łańcucha DNA wirusa, a Cas9 działa jak nożyczki, przecinając go.
W rzeczywistości CRISPR / Cas9 to tylko jeden z wielu podobnych systemów, które mają bakterie i archeony. Naukowcy dzielą je na dwie klasy. Pierwsza klasa obejmuje systemy CRISPR typu I, III i IV, a druga - II i V. Typ II zawiera białko Cas9 zaangażowane w pozyskiwanie nowych przerywników, gromadzenie się crRNA w komórce i cięcie DNA. W innych systemach do tych celów stosuje się kompleksy wielobiałkowe. To sprawia, że typ II jest najprostszym typem systemu CRISPR odpowiednim dla potrzeb inżynierii genetycznej.
Typy można z kolei podzielić na podtypy w zależności od tego, które dodatkowe geny są powiązane z CRISPR. Na przykład systemy IIA zawierają gen csn2, który koduje białko, które wiąże się z DNA i bierze udział w pozyskiwaniu przerywników. W systemach IIB nie ma csn2, ale istnieje gen cas4, którego funkcja jest nadal nieznana, a systemy IIC nie mają ani csn2, ani cas4.
Skarby wewnątrz bakterii
Film promocyjny:
Wszystkie znane systemy CRISPR zostały odkryte przez naukowców w bakteriach hodowanych w warunkach laboratoryjnych. Istnieje jednak ogromna liczba niehodowanych mikroorganizmów, do których należą zarówno archeony, jak i bakterie. Zwykle żyją w ekstremalnych warunkach - źródła mineralne lub toksyczne zbiorniki wodne w opuszczonych kopalniach. Jednak naukowcy mogą wyizolować z nich DNA i zidentyfikować w nim określone regiony. W nowym artykule opublikowanym 22 grudnia w Nature, genetycy z University of California w Berkeley rozszyfrowali genomy z naturalnych społeczności drobnoustrojów, odkrywając inne warianty systemu CRISPR.
Bakteriofag - wirus infekujący bakterie
Zdjęcie: Giovanni Cancemi / Depositphotos
Naukowcom udało się odkryć, że niektóre rodzaje mało zbadanych nanoorganizmów przypominających archeony ARMAN również posiadają CRISPR / Cas9, chociaż wcześniej uważano, że mają je tylko bakterie. Należy zauważyć, że system ten zajmuje pośrednie miejsce między podtypami IIC i IIB i może służyć jako ochrona przed pasożytniczymi „skaczącymi” genami (transpozonami) przedostającymi się do mikroorganizmu z innych archeonów. Próba odtworzenia aktywności archeonów CRISPR / Cas9 u E. coli (Escherichia coli) nie doprowadziła do niczego, co wskazuje na istnienie dodatkowych specyficznych mechanizmów regulujących system.
Z bakterii żyjących w wodach gruntowych i osadach wyizolowano również nowe typy systemów drugiej klasy, CRISPR / CasX i CRISPR / CasY. System CRISPR / CasX obejmuje białka Cas1, Cas2, Cas4 i CasX. Ten ostatni, jak wykazały eksperymenty na E. coli, wyróżnia się aktywnością nukleazy, to znaczy jest zdolny do cięcia obcego DNA, takiego jak Cas9. Jednak dzieje się tak tylko wtedy, gdy sekwencja TTCN znajduje się przed protoprzerywnikami, gdzie N jest dowolnym z czterech nukleotydów. Takie sekwencje nazywane są PAM (motyw sąsiadujący z protoprzerywnikiem - motyw sąsiadujący z protoprzerywnikiem). System CRISPR / Cas9 ma również swój własny PAM - NGG, który powinien znajdować się za protoprzerwą. Ponadto CRISPR / CasY jest w stanie przeciąć DNA, jeśli w pobliżu miejsca docelowego znajduje się sekwencja TA PAM.
Jaka jest obietnica tego odkrycia? Faktem jest, że wykryte systemy są najbardziej kompaktowymi znanymi w tej chwili. Zdaniem naukowców niewielka ilość białek potrzebnych do ich pracy sprawia, że CRISPR / CasX i CRISPR / CasY są wygodnymi narzędziami do edycji DNA. Ponadto badania metagenomiczne, w których bada się DNA pozyskane ze środowiska, ujawnią inne typy systemów CRISPR, które są przydatne w inżynierii genetycznej.
Droga do doskonałości
Oczywiście istnieje alternatywa dla poszukiwania systemów CRISPR w przyrodzie - ulepszenie już istniejącej technologii CRISPR / Cas9. Pomimo swojej wysokiej dokładności popełnia błędy, wycinając DNA w niewłaściwym miejscu. Utrudnia to dokonywanie prawidłowych zmian w genach, a tym samym skuteczne leczenie chorób dziedzicznych. Dlatego naukowcy szukają sposobów na poprawę wydajności systemu. W 2016 roku powstało wiele prac naukowych poświęconych modyfikowaniu CRISPR i przekształcaniu go w różne narzędzia genowe.
Białko Cas9 i crRNA - główne składniki systemu CRISPR
Zdjęcie: Steve Dixon / Feng Zhang / MIT
Tak więc 8 grudnia w czasopiśmie Cell opublikowano artykuł naukowców z Uniwersytetu w Toronto, którzy stworzyli „anty-CRISPR” - system, który wyłącza mechanizm pod pewnymi warunkami. Pozwala to na stłumienie aktywności Cas9, jeśli przewodnik RNA wiąże się z niewłaściwym fragmentem i zapobiega błędom. Anti-CRISPR składa się z trzech białek hamujących nukleazy. Oczywiście początkowo nie został wynaleziony przez naukowców, ale przez wirusy, które w ten sposób zneutralizowały odporność bakterii.
W czerwcu amerykańscy naukowcy wraz z kolegami z Rosji potwierdzili, że system CRISPR / C2c2, uzyskany z fusobacterium Leptotrichia shahii, jest zdolny do cięcia jednoniciowego RNA. W rezultacie system CRISPR może zostać użyty do wybicia - tłumienia funkcji - informacyjnego RNA, który przenosi informacje z genów do rybosomów, na których syntetyzowane są białka.
W maju naukowcy z Uniwersytetu Kalifornijskiego stworzyli technologię CRISPR-EZ, która umożliwia wprowadzenie nowych cząsteczek DNA do genomów mysich embrionów z prawie stuprocentowym sukcesem. System CRISPR / Cas9 wstrzykuje się do zapłodnionych jaj zwierzęcych za pomocą mikroskopijnej igły i niewielkiego wyładowania elektrycznego. W swoim eksperymencie naukowcom udało się wprowadzić mutację w genie u 88 procent myszy. To przewyższa liczbę genetycznie zmodyfikowanych myszy wyprodukowanych przez edycję CRISPR, która wykorzystuje konwencjonalne zastrzyki.
W kwietniu, przy użyciu zmutowanego wariantu Cas9 pozbawionego aktywności nukleazy, biolodzy molekularni z University of Massachusetts School of Medicine opracowali technologię CRISPRainbow. Przewodnik RNA, wskazujący miejsce wiązania enzymów, zawierał znaczniki fluorescencyjne, które umożliwiają np. Śledzenie ruchu ruchomych elementów genetycznych.
Komar Anopheles może być pierwszą ofiarą systemów CRISPR
Zdjęcie: Jim Gathany / Wikipedia
Odważny nowy świat
Naukowcy już używają systemów CRISPR do tworzenia organizmów zmodyfikowanych genetycznie, takich jak komary malarii, które rozprzestrzeniają szkodliwe geny wśród swoich dzikich krewnych. Ta metoda nazywa się napędem genowym. Jeśli jeden z rodziców osoby był nosicielem zmutowanego genu, przekaże go swojemu potomstwu z 50-procentowym prawdopodobieństwem. Dzieje się tak, ponieważ rodzic ma dwie kopie genu, a tylko jedna z nich jest uszkodzona. CRISPR jest w stanie skopiować zmutowany fragment i wstawić go do zdrowego genu. W rezultacie potomstwo otrzymuje mutację ze 100% prawdopodobieństwem.
W 2016 roku eksperci z Komitetu Doradczego ds. Rekombinacji DNA (RAC) zatwierdzili wniosek Uniwersytetu Pensylwanii o przeprowadzenie testów na modyfikację genetyczną człowieka przy użyciu technologii CRISPR / Cas9.
Jednak zostali wyprzedzeni przez Chińczyków. W listopadzie czasopismo Nature poinformowało, że chińscy naukowcy po raz pierwszy wprowadzili do ludzi komórki z genami zmodyfikowanymi przez system CRISPR / Cas9. Naukowcy wyekstrahowali komórki odpornościowe (limfocyty T) z krwi pacjenta z przerzutowym rakiem płuc, a następnie wykorzystali technologię CRISPR do wyłączenia genu kodującego białko PD-1. Wykazano, że ten ostatni tłumi odporność poprzez promowanie wzrostu guza. Naukowcy wyhodowali wyedytowane komórki, zwiększając ich liczbę, a następnie wstrzykując je z powrotem do ludzkiego ciała. Czas pokaże, czy terapia genowa poradzi sobie z chorobą.
Systemy CRISPR mogą być również wykorzystywane do zwalczania HIV i ludzkich chorób dziedzicznych. Konieczne są jednak dalsze badania, aby opracować skuteczne metody leczenia. Nie mówimy oczywiście o mutantach, jak w filmach science fiction, ale naukowcy będą w stanie szybko stworzyć organizmy zmodyfikowane genetycznie, takie jak rośliny rolnicze odporne na pasożyty. Dopiero okaże się, dlaczego naukowcy, którzy odkryli CRISPR i zorientowali się, jak można go użyć, nie otrzymali jeszcze Nagrody Nobla.
Alexander Enikeev
