Wynalezienie edytora genów CRISPR-Cas nazywa się rewolucją w biologii. Naukowcy obiecują, że wykorzystają go do ulepszania odmian roślin i ras zwierząt w rolnictwie, w leczeniu wrodzonych chorób genetycznych u ludzi. Korespondent RIA Novosti poszedł sprawdzić, kto i jak edytuje się genom.
Centrum edycji genomu Uniwersytetu Moskiewskiego zostało otwarte nieco ponad rok temu - na terenie kampusu. Spotyka mnie jej dyrektor, doktor chemii Peter Siergijew, a podczas jazdy windą poświęca trochę historii inżynierii genetycznej.
„Genom był już edytowany. Trudno było jednak stworzyć odpowiednie narzędzia, zajęło to dużo czasu, a rezultat często nie był taki, jakiego chcieliśmy”- mówi.
W wiwarium Piotr Władimirowicz przebiera się w niebieski strój laboratoryjny, daje mi jednorazowy biały kombinezon i proszą o przetarcie aparatu alkoholem. Teraz Petr Vladimirovich wygląda jak chirurg, a ja - jak asystent laboratoryjny z serii „CSI - Miejsce zbrodni”.
W sterylnym laboratorium przygotowano dla nas pojemnik z zapłodnionymi jajami myszy oraz probówkę z roztworem RNA. To wszystko, czego potrzebujesz do edycji genomu CRISPR-Cas.
CRISPR to angielski akronim wyrażenia, który dosłownie oznacza „regularnie pogrupowane krótkie palindromiczne powtórzenia”. W rzeczywistości są to tylko małe fragmenty DNA wirusów bakteriofagów osadzonych w genomie bakterii. Sekwencje te są potrzebne do funkcjonowania bakteryjnego układu odpornościowego i służą jako rodzaj ogłoszenia „poszukiwanego przez policję”. Jeśli bakteria przeżyje po zakażeniu bakteriofagiem, używa enzymów białka Cas do wycięcia fragmentu swojego DNA i wstawienia go do genomu w celu późniejszego rozpoznania. Genom bakterii dziedziczy tę bibliotekę „wrogów” starannie zebraną przez poprzednie pokolenia.
W 2013 roku naukowcy odkryli, że białko Cas działa w każdym organizmie, w tym u ssaków. Jest w stanie dokonać kierunkowych przerw w obu niciach cząsteczki DNA, a tym samym zmienić genom.
Film promocyjny:
Manipulacja jajami
Petr Siergijew wykonuje w mikro kuźni szklaną kapilarę o średnicy stu mikronów, wciąga do niej jajko i przenosi pod szkłem z pożywką. Gotowa próbka trafia na stolik optyczny mikroskopu. Monitor wyświetla powiększony obraz jajka, drżącego na końcu kapilary. Wyróżniają się dwie zaokrąglone plamki - są to przedjądrza z DNA matki i ojca.
Naukowiec przygotowuje kolejną kapilarę o rząd wielkości mniejszej średnicy. To jest strzykawka do wstrzyknięć. Zbiera roztwór zawierający dwa rodzaje RNA i za pomocą manipulatorów delikatnie przebija jajo. To wszystko, zastrzyk jest zrobiony.
RNA wstrzyknięte do jaja jest potrzebne do przecięcia genomu w danym miejscu. Jeden typ RNA zawiera ściśle określoną sekwencję nukleotydów, podobną do tej, którą zamierzaliśmy zmienić. Zadaniem tego RNA jest znalezienie odpowiedniego regionu w DNA, dlatego nazywa się je „przewodnikiem”. RNA drugiego typu, matrix, jest rodzajem instrukcji do syntezy białka nukleazy Cas9. Białko to działa jako katalizator reakcji chemicznej, która rozrywa wiązania fosfodiestrowe między dobrze określonymi zasadami DNA. Ponieważ cząsteczka białka ma dwa centra nukleazy, obie nici DNA są otwarte, ponadto w miejscu, którego współrzędne Cas9 „policzono” z przewodnikiem RNA.
Cząsteczka DNA postrzega pęknięcie obu nici jako poważną awarię i stara się ją naprawić. Enzymy egzonukleazy pływające w komórce natychmiast usuwają kilka nukleotydów z obu końców pęknięcia. To wystarczy, aby złamać lub, jak mówią genetycy, „wyłączyć” gen.
Jak działa edytor genomowy CRISPR-Cas9 / Ilustracja: RIA Novosti. Alina Polyanina.
Jeśli potrzebna jest np. Mutacja ukierunkowana, wymagane jest oznaczenie białka w celu śledzenia go w organizmie, to do kompleksu dodaje się kolejną matrycę do dwóch RNA w postaci specjalnie zaprojektowanego DNA. Składa się z sekwencji identycznych z krawędziami przyszłej przerwy, a także zawiera sekcję do wstawienia. Po tym, jak Cas9 przeciął cząsteczkę DNA, jej końce są połączone za pomocą tego dodatkowego szablonu, więc zestaw potrzebnych nukleotydów jest wstawiany do przerwy.
„Możemy przyczepić do wiewiórki mały ogon, dzięki czemu wygodnie jest ją wyciągnąć i zobaczyć, z czym oddziałuje. Możemy wstawić gen, ale nie jest to tak skuteczne, jak wyłączenie go”- wyjaśnia dalej naukowiec.
GMO i chimery
Zmodyfikowane jajo zostanie przeszczepione do macicy zastępczej myszy. Przez jakiś czas mieszkała z mężczyzną, którego kanaliki nasienne były związane. Para miała normalne życie seksualne, ale nie mogła począć. Niemniej jednak organizm myszy uważał, że jest w ciąży i tworzy dla niej odpowiednie tło hormonalne. Teraz ta samica rodzi czyjś płód.
Za trzy tygodnie urodzi najzwyklejsze myszy. Naukowcy zaczekają, aż gryzonie dorosną, wyjmą od nich mały kawałek ogona i wykorzystają PCR do analizy fragmentu DNA, który zmodyfikowali. W ponad połowie przypadków stwierdza się mutację lub uszkodzony gen. Procedura odwrotna - wstawienie sekwencji do genomu - kończy się powodzeniem w nie więcej niż 10% eksperymentów.
Podczas edycji pojawiają się różne ciekawe efekty. Na przykład rodzą się myszy mozaikowe lub chimery, które mają komórki z różnymi odmianami genomów matki i ojca. Cas9 może wielokrotnie ciąć DNA, ale informacyjny RNA kodujący go nie jest wieczny, a wstrzyknięty roztwór po prostu znika w serii podziałów komórkowych. Czasami redaktor nadal strzela ponownie po połączeniu przedjądrzy i udostępnieniu jaja. A ponieważ naprawa DNA po pęknięciu jest zawsze procesem losowym, a leczenie nigdy nie przebiega w ten sam sposób, to niektóre komórki w jednym organizmie będą zawierały inną mutację.
Dla nauki i medycyny
Wchodzimy do sąsiedniego pokoju, aby obejrzeć na żywo wyniki eksperymentów edycji genomu. Na półkach po lewej stronie - pojemniki z myszami modyfikowanymi genetycznie, po prawej - ze zwykłymi gryzoniami do kontroli. Wyrosły, jak te po lewej, ale genom nie został zmanipulowany. Myszy kontrolne są potrzebne, aby mieć przed oczami normę i porównać z nią stworzone w eksperymencie stworzenia.
Piotr Siergijew bierze jeden z pojemników z parą szarych myszy. Na zewnątrz są całkowicie zwyczajne, ale nie mają potomstwa. Faktem jest, że u mężczyzny wyłączany jest gen jednej z metylotransferaz RNA, enzymu wytwarzanego tylko w nasieniu. Samce z nieaktywnym genem rodzą się bezpłodne. Dokładny cel genu i enzymu jest nadal nieznany. Aby się tego dowiedzieć, w laboratorium wyhodowano dwa szczepy myszy: jeden miał wyłączony gen, drugi miał białko oznaczone edytorem genomu.
„Mutację tego genu stwierdza się również u ludzi - wtedy mężczyzna cierpi na bezpłodność. Ale dopóki nie dowiemy się, dlaczego jest potrzebny, dlaczego modyfikuje RNA, nie będziemy w stanie pomóc takim pacjentom - argumentuje naukowiec.
W rzeczywistości nadal nie znamy funkcji większości ludzkich genów. Dowiedzenie się tego jest podstawowym zadaniem, które rozwiązało wiele grup badawczych na całym świecie, w tym w Rosji. Genom myszy jest bardzo podobny do genomu ludzkiego. Mamy nadzieję, że z pomocą CRISPR-Cas badanie genomu każdego stworzenia będzie przebiegać szybciej.
Grupa Siergijewa wraz z N. N. NN Petrova zaczęła szukać mutacji prowadzących do niektórych typów raka. W najbliższych planach jest projekt stworzenia genetycznie zmodyfikowanych zwierząt dla rolnictwa we współpracy z Wszechrosyjskim Instytutem Badawczym Zootechniki i Instytutem Biologii Genów Rosyjskiej Akademii Nauk.
„CRISPR-Cas to fantastyczne narzędzie, które pozwala zmieniać genom według własnego uznania, aby być odrobiną Boga. Ostatecznie zadaniem nauki jest zrozumienie, jak działa tak złożone stworzenie jak ssak”- mówi naukowiec.
Rozwiązywanie fundamentalnych problemów nauki jest świetne, ale co ta technologia da medycynie? W dającej się przewidzieć przyszłości niestety niewiele. Łatwo jest edytować jajko i wychowywać genetycznie zmodyfikowaną mysz, ale niemożliwe jest poprawienie genów dorosłego zwierzęcia, nie mówiąc już o człowieku.
Metody edycji DNA w komórkach somatycznych (czyli już uformowanych komórkach) są nadal bardzo nieskuteczne. Aby wprowadzić do komórki jakiś gen wyłączony przez mutację i zmusić go do produkcji określonego białka, trzeba usunąć część komórek z organizmu, wyedytować zawarte w nich DNA i włożyć z powrotem do organizmu. W zasadzie istnieje nadzieja, że w ten sposób będzie można walczyć z takimi chorobami jak dystrofia mięśniowa Duchenne'a czy mukowiscydoza, kiedy konieczne będzie przywrócenie zdolności do pracy jakiejś części komórek. Jeśli chodzi o predyspozycje do raka, jak dotąd edytor genomu jest bezsilny. Jeśli zmutowany gen zostanie znaleziony u osoby, znajduje się on we wszystkich komórkach ciała. Zmiana ich wszystkich jest nierealna. A każda komórka z mutacją jest źródłem niebezpieczeństwa.
Ale nawet jeśli CRISPR / Cas pomoże odpowiedzieć tylko na niektóre fundamentalne pytania i pozwoli na leczenie rzadkich chorób genetycznych, nadal będzie to duży krok naprzód dla ludzkości.
Tatiana Pichugina