Międzynarodowy zespół naukowców ze Stanów Zjednoczonych, Francji i Chin stworzył półsyntetyczną formę życia. Chociaż podejmowano już próby uzyskania bakterii ze zmodyfikowanym DNA, mikroorganizmy rozmnażały się słabo, wymagały specjalnych warunków wzrostu i ostatecznie pozbywały się wprowadzonych do nich modyfikacji. „Lenta.ru” opowiada o nowej pracy, w której naukowcom udało się rozwiązać te problemy, uzyskując stworzenie radykalnie różniące się od wszelkiego naturalnego życia na Ziemi.
Nie tak dawno DNA wszystkich żywych organizmów na naszej planecie składało się z czterech rodzajów nukleotydów zawierających adeninę (A), tyminę (T), guaninę (G) lub cytozynę ©. Łańcuchy dziesiątek lub setek milionów nukleotydów tworzą oddzielne chromosomy. Geny znalezione na chromosomach są zasadniczo długimi sekwencjami nukleotydowymi, w których kodowane są sekwencje aminokwasowe białek. Połączenie trzech kolejnych nukleotydów (kodonu lub tripletu) odpowiada jednemu z 20 aminokwasów. Tak więc życie wykorzystuje trzyliterowy kod genetyczny (ATG, CGC itd.) Oparty na czteroliterowym alfabecie (A, C, T, G).
Kiedy komórka organizmu potrzebuje białka (polipeptydu), zostaje włączony gen, który ją koduje. Ten ostatni jest przyłączony do specjalnego enzymu zwanego polimerazą RNA, który w procesie transkrypcji zaczyna podążać za sekwencją nukleotydów i tworzyć jej kopię w postaci cząsteczki zwanej informacyjnym RNA (mRNA). RNA jest bardzo podobne do DNA, ale zamiast tyminy zawiera uracyl (U). Następnie mRNA opuszcza jądro komórkowe i trafia do rybosomów, gdzie służy jako przepis na tworzenie łańcucha aminokwasowego białka podczas translacji.
Naukowcy postanowili zmienić kod genetyczny Escherichia coli, dodając do niego dwie dodatkowe „litery”. Faktem jest, że DNA w żywych organizmach jest podwójne, to znaczy składa się z dwóch łańcuchów połączonych ze sobą komplementarnymi wiązaniami. Takie wiązania powstają między podstawą A-nukleotydu z jednej nici a zasadą T-nukleotydu z drugiej (podobnie między C i G). Z tego powodu dwa nowe syntetyczne nukleotydy muszą również być zdolne do komplementarnego parowania. Wybór padł na dNaM i d5SICS.
E. coli Escherichia coli
Zdjęcie: Rocky Mountain Laboratories / NIAID / NIH
Jedną parę syntetycznych nukleotydów wstawiono do plazmidu - dwuniciowej kolistej cząsteczki DNA zdolnej do namnażania się oddzielnie od reszty genomu bakterii. Zastąpili parę komplementarnych nukleotydów A i T, które były częścią operonu laktozy - zestawu genów, które metabolizują cukier laktozowy i związane z nimi niekodujące sekwencje DNA. Syntetyczne nukleotydy nie były zawarte w regionie, który kopiuje polimeraza w mRNA.
Film promocyjny:
Dlaczego naukowcy zdecydowali się nie wstawiać syntetycznych nukleotydów bezpośrednio do genu, ale obok niego? Faktem jest, że bardzo trudno jest zmienić gen w ten sposób, aby pozostał funkcjonalny. W końcu w tym celu musisz związać powstałe nowe kodony z dowolnym aminokwasem. W tym celu z kolei konieczne jest nauczenie komórki wytwarzania różnych typów transportowego RNA (tRNA), które mogą rozpoznawać te kodony.
Cząsteczki tRNA pełnią następującą funkcję. Podobnie jak ciężarówki, na jednym końcu niosą pewien aminokwas, zbliżają się do mRNA w rybosomach i z kolei zaczynają dopasowywać tryplet nukleotydów na drugim końcu do kodonu. Jeśli pasują, aminokwas jest usuwany i włączany do białka. Jeśli jednak nie ma odpowiedniego tRNA, białko nie zostanie zsyntetyzowane, co może negatywnie wpłynąć na żywotność komórek. Dlatego też, wprowadzając syntetyczne nukleotydy do genów, naukowcy musieliby stworzyć geny kodujące nowe tRNA, które potrafią rozpoznawać sztuczne kodony i przyłączać prawidłowy aminokwas do polipeptydu. Jednak zadanie badaczy było prostsze. Musieli się upewnić, że plazmid z syntetycznymi nukleotydami pomnoży się i zostanie przekazany organizmom potomnym.
Plazmidy użyte do transformacji Escherichia coli
Zdjęcie: Denis A. Malyshev / Kirandeep Dhami / Thomas Lavergne / Tingjian Chen / Nan Dai / Jeremy M. Foster / Ivan R. Correa / Floyd E. Romesberg / Nature / Department of Chemistry / The Scripps Research Institute
Ten plazmid, oznaczony pINF, wprowadzono do E. coli. Jednak aby go skopiować, konieczne jest, aby w komórce bakteryjnej było obecnych wiele nukleotydów. W tym celu do E. coli wstawiono inny plazmid, pCDF-1b. Zawierał gen dla okrzemek Phaeodactylum tricornutum PtNTT2, który koduje białko NTT, które transportuje nukleotydy z pożywki do komórki.
Jednak naukowcy napotkali szereg trudności. Po pierwsze, białka Phaeodactylum tricornutum mają toksyczny wpływ na komórki E. coli. Wszystko za sprawą obecności w nich fragmentu sekwencji aminokwasowej pełniącej funkcję sygnalizacyjną. Dzięki niej białko zajmuje prawidłową pozycję w komórce alg, po czym sekwencja zostaje usunięta. E. coli nie jest w stanie usunąć tego fragmentu, więc naukowcy jej pomogli. Udało im się usunąć pierwsze 65 aminokwasów z NTT. To znacznie zmniejszyło toksyczność, chociaż zmniejszyło również szybkość transportu nukleotydów.
Innym problemem było to, że syntetyczne nukleotydy były zatrzymywane w plazmidach przez długi czas i nie były zastępowane podczas kopiowania DNA. Jak się okazało, ich bezpieczeństwo zależało od otaczających ich nukleotydów. Aby się tego dowiedzieć, naukowcy przeanalizowali różne kombinacje osadzone w 16 plazmidach. Aby zrozumieć, czy syntetyczny nukleotyd wypadł z sekwencji, naukowcy zastosowali technologię CRISPR / Cas9.
CRISPR / Cas9
Zdjęcie: Steve Dixon / Feng Zhang / MIT
CRISPR / Cas9 to mechanizm molekularny, który istnieje wewnątrz bakterii i pozwala im zwalczać bakteriofagi. Innymi słowy, technologia ta zapewnia odporność na infekcje wirusowe. CRISPR to specjalny fragment DNA. Zawierają krótkie fragmenty wirusów DNA, które niegdyś zakażały przodków dzisiejszych bakterii, ale zostały pokonane przez ich wewnętrzną obronę.
Kiedy bakteriofag dostanie się do bakterii, fragmenty te są wykorzystywane jako matryca do syntezy cząsteczek zwanych crRNA. Powstaje wiele różnych łańcuchów RNA, które wiążą się z białkiem Cas9, którego zadaniem jest przecięcie DNA wirusa. Może to zrobić dopiero wtedy, gdy crRNA znajdzie komplementarny fragment wirusowego DNA.
Jeśli zamiast crRNA zostanie użyta sekwencja RNA komplementarna do określonego fragmentu plazmidu, Cas9 tnie również plazmid. Ale jeśli w tym fragmencie znajdują się syntetyczne nukleotydy, białko nie będzie działać. Zatem przy użyciu CRISPR można izolować te plazmidy, które są oporne na niepożądane mutacje. Okazało się, że w 13 z 16 plazmidów utrata syntetycznych nukleotydów była nieznaczna.
W ten sposób naukowcom udało się stworzyć organizm z fundamentalnymi zmianami w DNA, zdolnym do zatrzymywania ich w sobie w nieskończoność.
Chociaż półsyntetyczna forma życia ma tylko dwa nienaturalne nukleotydy w swoim genomie, które nie występują w kodonach i nie biorą udziału w kodowaniu aminokwasów, jest to pierwszy odporny organizm, którego alfabet DNA składa się z sześciu liter. W przyszłości naukowcy najprawdopodobniej będą mogli wykorzystać tę innowację do syntezy białek, tworząc w ten sposób pełnoprawny sztuczny kod genetyczny.
Alexander Enikeev